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培养基 手册2  

2009-05-04 16:20:57|  分类: ※※※※★植物学 |  标签: |举报 |字号 订阅

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8、污染是培养基质量不好引起的吗?

(1)培养基不是无菌产品,但有菌落数量控制。

(2)培养基在使用前通过高压或过滤灭菌。

(3)防止污染应该注意以下事项:

A.从污染的源头开始

确认工作细胞库是否被污染:用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。

确认毒种工作种子批是否被污染:用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。

确认所用培养基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染:用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。实际生产中,可以从配制好的培养液中取少量加入营养琼脂于恒温培养箱内培养,48小时即可观察有无污染。

一些单位在使用血清时候往往不经过过滤除菌处理便直接加入到培养液中,可能带来污染。

其它:高压灭菌设备、过滤除菌设备均应进行验证,确保灭菌和除菌效果;前者应在投产前及其后的每6个月进行验证,后者应在每次除菌前、后进行验证工作(至少应在除菌后进行一次)。

另外,应将有毒区与无毒区严格分开,并有各自独立的空气净化系统及孵室,有毒区对无毒区应保持相对负压,防止病毒对培养细胞(尤其是细胞库)的污染。

B.从GMP管理、SOP操作方面加强管理力度

每二周(或每周)对无菌操作室及洁净区域按GMP要求进行检测

人员的GMP管理和无菌操作强化培训

C.一些特殊情况

细菌的大小从0.1-700μm,为防止细小细菌的污染,过滤除菌应尽量采用0.1μm的滤膜或滤芯。

大面积污染时,应对所有设施、用具及操作环境进行彻底消毒。

9、如何消除组织培养的污染?

当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。

高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

(1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。

(2)分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

(3)每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。

(4)确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。

(5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

(6)重复步骤4。

(7)在无抗生素的培养基中培养4-6代,确定污染是否已被消除。

 

 

 

十一、培养基

培养基产品分为细胞培养基、平衡盐、细菌培养基产品。

(一)平衡盐(balanced salt solution,BSS)

1885年Sydney Ringer开发生理盐水发展而来,由无机盐、葡萄糖和水组成。平衡盐通常以其发明者命名,基本平衡盐溶液都是基于细胞需要钠、钾、钙、镁和磷酸盐这5种离子开发而来,只是在离子浓度和盐的形式上有所区别。

平衡盐的主要功能是维持细胞内外渗透压平衡、控制和维持酸碱平衡在生理范围之内、提供能量和代谢所需的无机离子。平衡盐培养基可用于配制培养用液基础液及细胞洗涤液。常用的平衡盐有:

1、Dulbecco,s平衡盐(D-PBS),不含碳酸氢钠;

2、Hanks,平衡盐(HBSS),含碳酸氢钠少,约0.35mg/L;

3、Earle,s平衡盐(EBSS),含碳酸氢钠多,约2.2mg/L;

4、PBS平衡盐,无Ca2+、Mg2+离子。

(二)细胞培养基

1、传统基础细胞培养基及其改良培养基

基础细胞培养基通常指基础合成培养基,主要成分为氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质(核酸降解物、氧化还原剂等)。

据不同细胞和研究目的,选用合适培养基,还可补加新成分。如杂交瘤中常用DMEM加丙酮酸钠、2-巯基乙醇(相当于胎牛血清可透析组分的作用)。

合成培养基使用时加5-30%血清。

(1)199细胞培养基及其改良品种

1950年由Morgan等设计,除BSS外,含有53种成分,添加适量的血清后,可广泛用于多种细胞培养、病毒学、疫苗生产等。

199(HB)细胞培养基,主要应用于Vero细胞、地鼠肾细胞转瓶培养生产狂犬、乙脑等疫苗,具有高缓冲性能,能够有效提高病毒滴度。

改良199细胞培养基——199(HB)细胞培养基

狂犬疫苗生产实践证明,199(HB)细胞培养基与传统199细胞培养基相比,具有以下优势。

 

 

a)细胞生长形态好

用199(HB)细胞培养基培养的细胞生长速度相对较快,形态良好。

细胞培养时间   199(HB)细胞培养基     199培养基

24小时   瓶壁铺满85%,良好,状态饱满   瓶壁铺满85%,良好,状态饱满

48小时   瓶壁铺满98%以上,细胞连接紧密,状态饱满   瓶壁铺满95%以上,形态良好,但细胞间尚有空隙。

72小时   细胞铺满整个瓶壁,因有轻微挤压变形成长条形,排列整齐,细胞间界线清晰。  细胞铺满整个瓶壁,有挤压变形状态。但排列不够整齐,细胞间界线不是很清晰。

b)营养液的pH较稳定

用199(HB)细胞培养基配制病毒维持液pH值较稳定,经过3-4天的细胞培养后pH值变化小。

c)病毒原液滴度高

用199(HB)细胞培养基收获的病毒原液相对用199培养基收获的病毒原液平均滴度要高,尤其对二次苗的影响。

199(HB)培养基 199培养基

一次苗滴度 二次苗滴度 一次苗滴度 二次苗滴度

6.86           6.43            6.63            5.83

注:一次苗、二次苗分别为第一次和第二次收毒。

d)纯化后原液的效力明显提高

用199(HB)细胞培养基培养后,对纯化后原液的效力影响比较明显,对效力有明显提高。

培养基     199(HB)培养基 199培养基

平均效力 4.24          3.49

(2)BME细胞培养基

基础Eagle培养基(Basal Medium Eagle),1955年由Eagle设计,BSS+12种氨基酸+谷氨酰胺+8种维生素。简单、便于添加,适于各种传代细胞系和特殊研究用,在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM等。

 

 

 

3)MEM细胞培养基

低限量Eagle培养基(Minimal Essential Medium),1959年修改配方,删去赖氨酸、生物素,增加氨基酸浓度,适合多种细胞单层生长,是一种最基本、适用范围最广的培养基,是一种被广泛应用的培养基。

需要注意的是,MEM细胞培养基有含Earle's平衡盐的类型,也有含Hanks'平衡盐的类型;有高压灭菌型的,也有过滤除菌型的;还有含非必需氨基酸的类型。生产和科研时,应根据实际情况注意选择合适的MEM细胞培养基。

另外,因MEM培养基营养成分所限,针对生产之特定细胞培养与表达时,并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。

(4)DMEM细胞培养基及其改良品种

DMEM由Dulbecco改良的Eagle培养基,各成份量加倍,分低糖(1000mg/L)、高糖(4500mg/L)。细胞生长快。附着稍差的肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好,常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。例如CHO细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达EPO。

改良DMEM细胞培养基——DMEM(HED)细胞培养基

DMEM(HED)细胞培养基,培养CHO细胞生产乙肝疫苗,具有较强细胞维持能力,可增加收液次数,有效提高蛋白表达率。

生产和试验研究证明,DMEM(HED)细胞培养基在细胞生长和病毒分泌方面均优于使用DMEM细胞培养基。

a)使用DMEM(HED)细胞培养基细胞贴壁和长满单层时间明显快于传统DMEM细胞培养基,维持2个月细胞未出现脱落现象。

使用DMEM(HED)细胞培养基,在接种后第2天, 80%细胞已伸展并开始分裂增殖,第3天已长成较密单层,细胞贴壁均匀,形态清晰,呈多边形和梭形,细胞间略有空隙,细胞数为7.5 x 106个/ml。在此后转瓶培养的60 d内细胞数保持稳定,无明显增加和减少,无脱落,无明显形态变化,培养液中HBsAg滴度稳定在1:128~1:512之间。而使用传统DMEM细胞培养基,只有30%和40%的细胞伸展,至第4天才长成较密单层,小方瓶与双层转瓶结果相同。至30 d 时已长成较厚的复层,并开始大片脱落,细胞数明显减少,HBsAg滴度降低,最低降到1:32 。此后细胞开始重新贴壁、增殖,至45 d左右部分细胞长成单层,一部分细胞因脱落,至60 d时仍未能长满转瓶。

b)分泌HBsAg量明显高于传统DMEM细胞培养基组。

培养基              DMEM(HED)细胞培养基 DMEM细胞培养基

30次收液中平均HBsAg含量 3.75μg/ml 3.51μg/ml

(5)IMDM细胞培养基

IMDM是由Iscove's改良的Eagle培养基,增加了几种氨基酸和胱氨酸量。可用于杂交瘤细胞培养,以及无血清培养的基础培养基。

(6)RPMI-1640细胞培养基

Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制,针对淋巴细胞培养设计,BSS+21种氨基酸+维生素11种等,广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞,也用做悬浮细胞培养。

 

 

(7)Fischer’s细胞培养基

用于白血病微粒细胞培养。

(8)HamF10、F12细胞培养基

1963年、1969年由Ham设计,含微量元素,可在血清含量低时用,适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞,F12适用于CHO细胞。

(9)DMEM/F12细胞培养基

DMEM和F12细胞培养基按照1:1比例混合效果最佳,营养成分丰富,且可以使用较少血清,或作为无血清培养基的基础培养基。

2、低血清细胞培养基

血清对于在传统培养基配方中生长和增殖的大多数细胞系来说是必不可少的。大部分的组织培养研究者非常熟悉血清添加物给予基本培养基配方的良好生长支持特征。然而,伴随血清的使用也带来了很多的问题。

费用因素

生产血清费用高而效率低。小牛血清还必须来源于没有疯牛病、口蹄疫和其它高度传染性疾病的地区。

差异

所有的血清都是一种成分不确定的混合物,血清批与批之间的组分存在差异。

传染源

动物血清有可能携带传染源,包括支原体、病毒和有毒物质。任何一种传染源可能对正在生长的细胞系或者制品带来风险。

法规问题

为了使与传染源相关的风险减少到最低,存在多个国家间进出口生物材料的国际法规。

为了解决这些问题,清大天一公司开发了多种营养培养基,以最小化和消除与使用动物血清相关的制品安全性问题。

(1)低血清细胞培养基的原理

通常在用传统培养基培养细胞时须加入约10%的小牛血清,低血清培养基是在基础培养基中添加了额外的营养成分,使小牛血清的添加量减少50%到70%,而对于细胞生长、增殖、形态和功能有较小或者没有影响。

 

 

 

(2)低血清培养基的优点

小牛血清是细胞培养液成本最大的原料,使用低血清培养基明显地节省培养液成本。

减少制品纯化损失,提高纯化收率,便于分离纯化。

减少由于不确定蛋白或者其它血清组分带来干扰和差异的风险。

提高制品安全性。

批间差减少或影响降低:

a)血清用量减少可以减少使用批次。

b)血清用量减少使得批间差的影响减少。

细胞在低血清培养基的生长相当或者优于加入10%小牛血清的传统培养基,没有观察到在细胞形态及增殖方面的显著差异。

(3)低血清细胞培养基的应用

VERO细胞、BHK21细胞等细胞在转瓶、微载体反应器中的培养。

5、无血清无动物组分细胞培养基

无血清无动物组分细胞培养基意指以该培养基配制的培养液无须添加牛血清即可培养细胞和维持生长收液,且该培养基成分中不含有任何动物来源成分。

在细胞培养生产生物制品过程中无须添加动物来源成分,避免疯牛病、口蹄疫等传播进入人体,减少人、兽在使用生物制品时的特异性免疫反应、降低产品成本(如降低培养液成本,简化下游纯化工作及提高产品收获量等)。采用生物反应器、无血清无动物来源成分培养基进行细胞培养制药是21世纪生物制药发展趋势;美国FDA和美国农业部已经严格控制在细胞培养中胎牛血清的使用。

同时,高密度细胞培养并长时间维持细胞密度是高表达率和高产量的关键,只能通过无血清悬浮培养技术来实现。

为了获得足够的营养成分,无血清无动物组分细胞培养基中氨基酸含量倍增,另外添加了生长因子和/或细胞因子,以及含有个别蛋白或大量蛋白的组分。

无血清无动物组分细胞培养基通常是特定细胞专用培养基,如无血清无动物组分CHO悬浮细胞培养基适用于CHO悬浮细胞。

6、替代天然培养基

培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分,所有的成分均有已知的化学结构。

(三)细菌培养基

细菌培养基为肺炎、流脑等细菌培养疫苗生产专用培养基。用于细菌性疫苗大规模生产中细菌体的培养及实验室中细菌体的研究培养。

目前细菌性疫苗生产厂家及实验室都使用自行配制的培养基进行细菌体的繁殖培养,由于配制工艺的不同、各种培养基组分来源不同,以及培养基中重要活性添加剂来源的质量不稳定性,导致了细菌体繁殖培养的数量和质量不稳定,批间差较大,结果时好时坏,该结果不仅给培养基使用者增加了成本,还严重影响了疫苗生产厂家的产量和质量,延误科研进程。

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